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pUCm-T载体(pUCm-T Vector)是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片段的重组克隆。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3'端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3'端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片段的重组载体。

pUCm-T载体是在pUC19载体的基础上改造而成，除多克隆位点外，其余序列同pUC19(GenBank Accession Number：M77789)。

少量自连的载体转化得到的克隆由于编码了LacZ基因，而在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。大部分重组的载体，由于插入片段破坏了LacZ基因，因而在IPTG/X-Gal平板上转化得到白色克隆。这样就可以通过蓝白斑非常容易地筛选出重组克隆，蓝白斑筛选结果示意图如下图。

• pUCm-T载体中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pUCm-T)包括：
  

  Afl II	Age I	Apa I	Asc I	Avr II	Bbs I	Bbv II	Bcl I
  Blp I	BsaA I	BseR I	Bsg I	BsiC I	BsiW I	Bsm I	BsmF I
  Bsp120 I	BspM II	BsrG I	BssH II	Bst1107 I	BstB I	BstE II	BstX I
  Bsu36 I	Dra III	Eco47 III	Eco72 I	Esp I	Fse I	Hpa I	Mlu I
  Msc I	Mun I	Nae I	NgoM I	Nhe I	Nru I	Nsi I	PflM I
  Pme I	Pml I	PpuM I	PspA I	Rsr II	Sac II	Sfi I	Sma I
  SnaB I	Spe I	Spl I	Srf I	Stu I	Xca I	Xma I

  
  
• pUCm-T载体中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pUCm-T once)包括：
  

  HinD III	A`AGCT,T	234		Acc65 I	G`GTAC,C	360
  BspM I	ACCTGC 10/14	239		Asp718	G`GTAC,C	360
  Sph I	G,CATG`C	244		Kpn I	G,GTAC`C	364
  Sal I	G`TCGA,C	252		Ban II	G,RGCY`C	370
  Acc I	GT`MK,AC	253		Sac I	G,AGCT`C	370
  HinC II	GTY|RAC	254		Apo I	R`AATT,Y	372
  Hind II	GTY|RAC	254		EcoR I	G`AATT,C	372
  Xba I	T`CTAG,A	258		Kas I	G`GCGC,C	533
  Ava I	C`YCGR,G	264		Nar I	GG`CG,CC	534
  PaeR7 I	C`TCGA,G	264		Ehe I	GGC|GCC	535
  Xho I	C`TCGA,G	264		Bbe I	G,GCGC`C	537
  BamH I	G`GATC,C	270		EcoO109 I	RG`GNC,CY	780
  BsaB I	GATNN|NNATC	275		Aat II	G,ACGT`C	841
  Bgl II	A`GATC,T	276		Ssp I	AAT|ATT	955
  Xcm I	CCANNNN,N`NNNNTGG	289		Xmn I	GAANN|NNTTC	1160
  Tth111 I	GACN`N,NGTC	293		Bsp1286 I	G,DGCH`C	1177
  Not I	GC`GGCC,GC	305		Sca I	AGT|ACT	1279
  Eag I	C`GGCC,G	305		EcoN I	CCTNN`N,NNAGG	1399
  Xma III	C`GGCC,G	305		Cfr10 I	R`CCGG,Y	1675
  Dsa I	C`CRYG,G	312		Bsa I	GGTCTC 7/11	1694
  Nco I	C`CATG,G	312		Ahd I	GACNN,N`NNGTC	1760
  Sty I	C`CWWG,G	312		AlwN I	CAG,NNN`CTG	2239
  EcoR V	GAT|ATC	320		Afl III	A`CRYG,T	2648
  Cla I	AT`CG,AT	325		Sap I	GCTCTTC 8/11	2765

• 对于重组的质粒可以使用载体多克隆位点上的两个PstI酶切位点进行PstI单酶切鉴定，也可以使用廉价且高效的EcoRI、BamHI、XbaI、HindIII等内切酶进行双酶切鉴定。
  
• 构建完成的质粒可以通过质粒上的正反两个M13引物位点进行测序或通过T7 promoter上的T7引物位点进行测序。
  
• 构建完成的质粒可以利用T7 RNA polymerase promoter进行体外转录，用于探针标记等。
  
• DNA聚合酶是否可以在PCR产物3'端加A需参考该DNA聚合酶的说明。对于PCR产物为平端的情况，不适合用于T载体的连接反应。对于平端的PCR产物可以先进行在3'端加A的反应，再用T载体进行克隆。
  
• 进行PCR产物克隆时需自备连接、转化等相关试剂、试剂盒。

• PCR产物纯化：
  
  • PCR产物可以通过PCR纯化试剂盒或凝胶回收试剂盒(例如百奥莱博的YT009 PCR纯化试剂盒或YT010 DNA凝胶回收试剂盒)进行PCR产物纯化。对于PCR产物条带不是非常单一的情况，宜采用电泳后DNA凝胶回收的纯化方法，这样可以去除PCR扩增出来的非特异性条带的干扰。
• 连接反应：
  
  • 对于常规的DNA ligase连接反应，请参考下面的连接反应体系，或按DNA ligase的说明书进行操作。每个连接反应使用1μL pUCm-T载体，约0.2pmol PCR产物，在20μL连接体系中16℃连接过夜。
    

    成分	用量
    Sterilized Water	x μL
    10×T4 DNA Ligase Buffer	2μL
    Purified PCR Product	y μL
    pUCm-T Vector	1μL
    T4 DNA Ligase (5～10U/μＬ)	1μL
    总体积	20μL

    
    
  • 对于快速连接试剂盒，请参考相应说明书进行连接反应。pUCm-T载体的用量还是为1μL，PCR产物的推荐用量约为0.2pmol。实际做连接反应时对PCR产物的使用量没有必要严格定量，根据PCR产物的亮度大致加入适量的PCR产物进行连接反应即可获得比较理想的连接效果。连接反应中使用的水尽量使用Milli-Q级纯水，或使用双蒸水或三蒸水。
• 转化和筛选阳性克隆：
  按照常规方法进行转化和蓝白斑筛选。转化可以采用百奥莱博的超级感受态细菌制备试剂盒(货号：YT023)。蓝白斑筛选所需的IPTG(货号：YT430)和X-Gal(货号：YTB6192)可以向百奥莱博购买。对于白斑可以进行酶切鉴定，通常酶切鉴定正确后可以进行测序鉴定。